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顯色是ELISA中的后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色，隨即逐漸減弱，至2小時后即可消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

ELISA實驗之比色

比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可平妥坐入座架中。比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

ELISA顯色淡的原因如下：

原因一：試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高。

解決方案：盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫。

原因二：試劑盒未充分平衡。

解決方案：試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。

原因三：培養(yǎng)箱溫度不足37℃。

解決方案：注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應注意。

原因四：保溫時間不足。

解決方案：校正定時鐘準確定時。

原因五：洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加。

解決方案：按說明書要求保留洗滌時間，準確記住洗滌次數。

原因六：移液器吸液量不足，吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔。

解決方案：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密，吸嘴內壁要清潔，一次性使用。

原因七：蒸餾水水質有問題。

解決方案：使用新鮮合格的蒸餾。

原因八：底物作用時間不足。

解決方案：準確定時。

上是通慰生物關于ELISA顯色淡的原因有哪些，希望可以幫助到大家。顯色一定要控制時間，根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。